蓝白斑筛选法

浏览次数:632次发布时间: 2020-01-17 来源:海南三亚白癜风医院

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  蓝白斑筛选法_生物学_自然科学_专业原料。测验十五 重组子的筛选技巧 --蓝白斑筛选法 【测验方针】 练习蓝白斑法筛选重组菌落的道理及的确的测验操作流程。 【测验资料】 移液器及吸咀 作育皿 接种环 1.5mL离心管 恒温作育箱 水浴锅

  测验十五 重组子的筛选技巧 --蓝白斑筛选法 【测验方针】 练习蓝白斑法筛选重组菌落的道理及的确的测验操作流程。 【测验资料】 移液器及吸咀 作育皿 接种环 1.5mL离心管 恒温作育箱 水浴锅 ?LB液体作育基 卵白胨 8g 氯化钠 7g 酵母 5g 定容至1000mL,用NaOH调pH至7.5~7.6,可置-20℃保管, 高压灭菌 ?LB固体作育基 液体作育基中参预1.5%的琼脂,15磅30分钟高压灭菌后操纵 ?X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖) X-gal溶于N, N’-二甲基甲酰胺中配20mg/mL原夜,-20℃避光 保管 ?IPTG(异丙基-?-D-半乳糖苷) 0.2g/mL分装,储存于-20℃ ?氨苄青霉素(Ampicillin) 1g Ampicillin溶于5mL灭菌水中,配成母液,保管于-20℃ ?转化菌 【测验道理】 β-半乳糖苷酶是一种把乳糖分析成葡萄糖和半乳糖的酶,最 常用的β-半乳糖苷酶基因来自高肠杆菌lac运用子,它们使载体 中带有大肠杆菌lac运用子的调治序列和编码β-半乳糖苷酶N末 端146个氨基酸的序列。用异丙基-?-D-半乳糖苷(IPTG)可诱导 这个结尾片断的合成,合成的片断能与宿主编码的β-半乳糖苷 酶缺陷型实行互补,收复该酶的活性,这一流程称为α-互补。 【测验道理】 因为克隆用载体pGEM-T Easy Vector带有lacZ的调治序列和 β-半乳糖苷酶的片面编码序列,可能与缺陷型宿主DH 5α正在诱 导物IPTG存不才,造成α-互补,宿主菌正在含色素底物X-gal的 作育基平板上造成蓝斑;正在有外源DNA片断插入到载体众克隆 位点时,就使载体编码β-半乳糖苷酶的片面序列失活,带有重 组质粒的宿主菌形成白斑。为升高筛选的凿凿性,测验中采用 蓝白斑筛选法。 X-gal和IPTG的效力 IPTG可诱导缺陷型大肠杆菌DH 5α外达出半乳糖苷酶,该酶 可分析增加于作育基中无色的X-gal成半乳糖和深蓝色的底物5溴-4-氯-靛蓝,使菌落吐露出蓝色响应;正在T质粒载体lacZα 序列中,含有一系列差异限度酶的简单识别位点,此中任何一 个位点插入了外源克隆DNA片断,都市阻断半乳糖苷酶的读码 布局,使其编码的α肽遗失活性,结果形成出白色的菌落。因 此,按照这种半乳糖苷酶的显色响应,便可检测出含有外源D NA插入序列的重组克隆。 【测验方法】 1、平板的计算 正在40uL X-gal中参预4uL IPTG,充溢夹杂,正在无菌要求下涂 布于含Amp(浓度为50ug/mL)的LB平板上,将平板置于37℃恒温 箱中2~3hr,以使作育基充溢罗致色素底物X-gal; 2、涂板 将转化菌正在无菌要求下涂布于含抗生素和X-gal、IPTG的平 板上,正面朝上安置30分钟,待菌液全部被罗致后颠倒平板, 37℃作育12~18hr; 3、窥探测验结果 蓝白斑筛选重组菌落 涂布 液体作育 增加有氨苄青霉素、X-gal 挑取白 色菌落 连合产品 和IPTG的固体作育基 37℃作育12~16h . . .…..….. . . ….. .. . . .…...….. . .….. . .

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